研究背景
酒精相關(guān)性肝病是肝移植的主要指征，也是死亡的主要原因。腸道菌群的改變與酒精相關(guān)性肝病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。酒精相關(guān)性肝病患者糞便中念珠菌的比例增加，但腸道念珠菌與其宿主之間的相互作用，尤其是它們對酒精相關(guān)性肝病的作用仍知之甚少。β-葡聚糖是許多共生真菌的細(xì)胞壁成分，與肝巨噬細(xì)胞上的C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族7成員A（CLEC7A；也稱為DECTIN1）結(jié)合，以釋放白介素-1β（IL-1β），增加小鼠酒精相關(guān)性肝病的嚴(yán)重程度。酵母白色念珠菌（C. albicans）通常以無害的形式存在于人體的腸道中，但在易感人群（例如免疫功能低下的患者）中可以從腸道轉(zhuǎn)移到血液中。最近的研究表明Ece1是細(xì)胞伸長程度1（ECE1）基因的產(chǎn)物，對白色念珠菌的粘膜發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。Ece1-III 62-92K稱為念珠菌溶血素，是一種分泌的溶細(xì)胞肽（外毒素），對宿主的上皮細(xì)胞損傷至關(guān)重要。在這項研究中，作者評估了白色念珠菌及其外毒素念珠菌溶血素在酒精相關(guān)性肝病中的作用。
研究結(jié)果
酒精性肝炎患者糞便中念珠菌溶血素陽性白色念珠菌數(shù)量增加
白色念珠菌是人體腸道菌群的常見真菌。作者通過ITS測序發(fā)現(xiàn)酗酒患者中白色念珠菌的比例增加。為了確定糞便真菌中活菌的含量，作者對對照組（對照，n = 11），酗酒患者（n = 42）和酒精性肝炎患者（n = 91）的糞便樣本進(jìn)行了真菌培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組和酗酒患者的培養(yǎng)物相比，酒精性肝炎患者的糞便樣品中真菌或白色念珠菌明顯增加。此外，與酗酒患者相比，酒精性肝炎患者中真菌或白色念珠菌的比例也增加。作者進(jìn)一步檢測了酒精性肝炎患者中編碼白色念珠菌外毒素念珠菌溶血素的基因ECE1是否增加。結(jié)果發(fā)現(xiàn)30.77％的酒精性肝炎患者的ECE1檢測呈陽性，而在酗酒患者中，這一比例顯著降低。以上結(jié)果說明酒精性肝炎患者糞便中念珠菌溶血素陽性白色念珠菌數(shù)量增加。
念珠菌溶血素加劇了酒精相關(guān)性肝病
為了研究念珠菌溶血素陽性的白色念珠菌在酒精相關(guān)性肝病中的作用，作者在乙醇喂養(yǎng)期間反復(fù)對小鼠進(jìn)行白色念珠菌（每三天108個CFU）灌胃處理。與PBS處理的小鼠相比，定植野生型白色念珠菌的小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的乙醇相關(guān)性肝損傷，表現(xiàn)為血清ALT水平升高，肝脂肪變性增加，Il1b基因，趨化因子（C-X-C基序）配體1（Cxcl1）和Cxcl2的表達(dá)增加。為了確定這種疾病的惡化效果是否取決于ECE1，作者將ECE1基因缺失（ece1D / D）的白色念珠菌菌株定植在小鼠體內(nèi)。這些小鼠的乙醇相關(guān)性肝損傷，脂肪變性和炎癥程度較輕。將ECE1重新導(dǎo)入ece1D / D株（ece1D / D + ECE1）中，并用該菌株在小鼠體內(nèi)定植，與乙醇處理后野生型白色念珠菌定植的小鼠產(chǎn)生的肝損傷，脂肪變性和炎癥水平相當(dāng)。這些結(jié)果表明ECE1的基因產(chǎn)物對于白色念珠菌加重乙醇相關(guān)性肝病至關(guān)重要。
ECE1編碼由8種不同的肽組成的多蛋白，念珠菌溶血素是其中的一種分泌型的溶細(xì)胞肽外毒素。為了檢測念珠菌溶血素是否導(dǎo)致ECE1介導(dǎo)的乙醇相關(guān)性疾病的增加，作者將攜帶Ece1-III62–93念珠菌溶血素編碼區(qū)（ece1D / D + ECE1D184–279）缺失的白色念珠菌菌株在小鼠體內(nèi)定殖，因此不產(chǎn)生念珠菌溶血素。與定植ece1D / D白色念珠菌菌株的小鼠相比，這些小鼠表現(xiàn)出相似的癥狀，表明念珠菌溶血素對于白色念珠菌加重乙醇誘發(fā)的肝病是必需的。此外，念珠菌溶血素與死亡率增加有關(guān)。與定植念珠菌溶血素陰性菌株的小鼠相比，定植念珠菌溶血素陽性菌株的小鼠死亡率顯著增加。此外，白色念珠菌菌株不影響乙醇的腸道吸收或肝臟代謝，血清乙醇水平以及肝醇脫氫酶1（Adh1）和細(xì)胞色素P450家族2亞家族E多肽1（Cyp2e1）的表達(dá)，在各組之間沒有顯著差異。這些結(jié)果表明產(chǎn)生念珠菌溶血素的白色念珠菌可增加乙醇相關(guān)的肝病和小鼠的死亡率（圖2）。
念珠菌溶血素加劇了乙醇誘導(dǎo)的脂肪性肝炎，而與骨髓源性細(xì)胞上的受體CLEC7A無關(guān)
β-葡聚糖是大多數(shù)真菌物種（包括白色念珠菌）中最豐富的細(xì)胞壁多糖。CLEC7A是一種模式識別受體，可識別多種β-葡聚糖，從而激活宿主免疫反應(yīng)。 CLEC7A主要在髓樣細(xì)胞上表達(dá)，僅在肝臟中的Kupffer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)。作者之前已經(jīng)證明從Kupffer細(xì)胞中丟失CLEC7A會減輕乙醇誘導(dǎo)的脂肪性肝炎。為了研究白色念珠菌的促病作用是否由CLEC7A信號傳導(dǎo)介導(dǎo)，作者用氯膦酸鹽介導(dǎo)Kupffer細(xì)胞耗竭，輻射和骨髓移植相結(jié)合的方法，產(chǎn)生了CLEC7A骨髓嵌合小鼠。用野生型白色念珠菌，ece1D / D白色念珠菌（ece1D / D）或PBS處理嵌合小鼠，并進(jìn)行長期乙醇喂養(yǎng)。與PBS處理的小鼠和定植ECE1基因缺失的白色念珠菌菌株的小鼠相比，缺少CLEC7A并被野生型白色念珠菌定植的嵌合小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的乙醇誘導(dǎo)的肝損傷，脂肪變性和炎癥。在所有組中，均未觀察到血清乙醇水平，Adh1和Cyp2e1表達(dá)的顯著差異。這些結(jié)果表明在給予乙醇后，白色念珠菌和念珠菌溶血素可誘導(dǎo)肝臟疾病，這不依賴于Kupffer細(xì)胞和其他骨髓來源細(xì)胞的CLEC7A信號傳導(dǎo)。
念珠菌溶血素不影響腸道通透性
在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，念珠菌溶血素引起腸道上皮細(xì)胞壞死，這是白色念珠菌通過腸道轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。為了確定念珠菌溶血素是否在體內(nèi)誘發(fā)腸屏障功能障礙，作者通過測量葡聚糖的回收率來確定腸道通透性。與作者之前的報道一致，乙醇飲食小鼠的腸道通透性增加。但是乙醇處理后，在野生型白色念珠菌，ece1D / D白色念珠菌（ece1D / D）和PBS處理的小鼠中，未觀察到明顯差異。腸脂肪酸結(jié)合蛋白（IFABP）在腸上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，并在腸上皮細(xì)胞損傷后釋放到體循環(huán)。作者通過ELISA對血清IFABP進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)兩組之間的腸上皮損傷沒有差異。這些結(jié)果表明在乙醇喂養(yǎng)的小鼠中，念珠菌溶血素不會引起腸屏障破壞或腸上皮細(xì)胞死亡。
念珠菌溶血素對原代肝細(xì)胞具有細(xì)胞毒性
為了進(jìn)一步明確念珠菌溶血素加重乙醇相關(guān)性肝病的機(jī)制，作者從正常飲食或長期乙醇喂養(yǎng)的小鼠中分離了原代肝細(xì)胞。將培養(yǎng)的肝細(xì)胞與念珠菌溶血素共同孵育。與對照肽孵育的肝細(xì)胞相比，念珠菌溶血素劑量依賴性地導(dǎo)致培養(yǎng)的肝細(xì)胞死亡。與從對照組小鼠體內(nèi)分離的肝細(xì)胞相比，乙醇喂養(yǎng)小鼠的肝細(xì)胞顯示出相似的細(xì)胞毒性。但是乙醇孵育會增加念珠菌溶血素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明念珠菌溶血素可以直接損傷肝細(xì)胞，并且在乙醇刺激下可以增加細(xì)胞毒性作用。
念珠菌溶血素與酒精性肝炎的嚴(yán)重程度和死亡率有關(guān)
酒精相關(guān)的肝病可能會發(fā)展為酒精性肝炎，具有很高的發(fā)病率和死亡率。因此，作者分析了酒精性肝炎患者的臨床參數(shù)和結(jié)局，患者的糞便中念珠菌溶血素編碼基因ECE1呈陽性。與ECE1陰性患者相比，含有念珠菌溶血素遺傳物質(zhì)的患者糞便樣品的MELD評分更高。在單變量logistic回歸分析中，MELD評分與ECE1的檢測顯著相關(guān)（表1）。酒精性肝炎患者中ECE1的檢測與90天死亡率的增加進(jìn)一步相關(guān)，調(diào)整后的危險比為3.01（1.02-8.87，p = 0.046）。此外，酒精性肝炎的ECE1陽性患者中有28.42％在入院90天內(nèi)死亡，而ECE1陰性患者中有11.71％在入院90天內(nèi)死亡（Log-rankp = 0.044），以上結(jié)果說明念珠菌溶血素與酒精性肝炎的嚴(yán)重程度和死亡率有關(guān)。
結(jié)論
酒精性肝炎患者的糞便白色念珠菌和ECE1水平升高。
念珠菌溶血素可加重乙醇誘導(dǎo)的肝病，并增加小鼠的死亡率。
念珠菌溶血素以劑量依賴性方式損害肝細(xì)胞。
念珠菌溶血素與酒精性肝炎患者的肝病嚴(yán)重程度和死亡率有關(guān)。
參考資料：Chu H, Duan Y, LangS, Jiang L, Wang Y, Llorente C, Liu J, Mogavero S, Bosques-Padilla F, AbraldesJG, Vargas V, Tu XM, Yang L, Hou X, Hube B, St?rkel P, Schnabl B. The Candidaalbicans exotoxin candidalysin promotes alcohol-associated liver disease. JHepatol. 2020 Mar;72(3):391-400.
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